توسعه روش های جدید خوراک دهی در کشت های غیرمداوم با خوراک دهی مخمر پیکیا پاستوریس برای افزایش تولید پروتئین نوترکیب

در بخش اول این پژوهش، از سویه پیکیا پاستوریس فنوتیپ mut+ تولید کننده درون سلولی آنزیم بتا-گالاکتوزیداز برای مطالعه راهبردهای متداول خوراک دهی متانول و توسعه راهبرد جدیدی استفاده شد. سه راهبرد متداول خوراک دهی، شامل µ-stat، do-stat و غلظت متانول ثابت مطالعه شدند و از نظر فعالیت آنزیم های الکل اکسیداز، فرمات دهیدروژناز و بتا-گالاکتوزیداز، وزن خشک سلولی، غلظت فرمالدهید و غلظت متانول با یکدیگر مقایسه شدند. در روش خوراک دهی متانول با µ-stat h-1 025/0 بالاترین فعالیت بتا-گالاکتوزیداز به دست آمد. یک راهبرد جدید خوراک دهی بر پایه داده های حاصل از مطالعه راهبردهای متداول خوراک دهی توسعه یافت که در آن خوراک دهی متانول به مدت 5 ساعت با µ-stat h-1 025/0 شروع شد، پس از آن با خوراک دهی متانول µ-stat h-1 030/0 تا قبل از شرایط محدودیت اکسیژن ادامه یافت و در نهایت با مشکل شدن کنترل اکسیژن محلول در 20% اشباع هوا به do-stat تغییر یافت. کاربرد این خوراک دهی جدید منتج به وزن خشک سلولی g/l 2/107، فعالیت ویژه الکل اکسیداز u/mgcdw 1890/0 و فعالیت بتا-گالاکتوزیداز ku/ml 5/173 پس از 29 ساعت از تخمیر شد، که به ترتیب افزایشی 6/5، 1/29 و 7/15 درصدی نسبت به خوراک دهی µ-stat h-1 025/0 نشان می دهد. در بخش دیگری از پژوهش حاضر، با استفاده از سویه پیکیا پاستوریس فنوتیپ muts و تولید کننده برون سلولی سرم آلبومین انسانی، کشت غیرمداوم با خوراک دهی جدیدی در شرایط نیتروژن محدود ارائه شده است. در این روش خوراک دهی، منبع نیتروژن لازم برای رشد سلولی و تولید پروتئین نوترکیب با انتخاب هیدروکسید آمونیوم به عنوان باز در کنترل ph تأمین می شود؛ با تغییر پیش فرض های ton و toff کنترل کننده ph سرعت تیتراسیون یا به عبارتی سرعت افزودن باز برای تنظیم ph تغییر می کند و از این طریق سرعت رشد سلولی کنترل می شود. تنظیم نسبت ton/toff در 5/0 بر 10 و 5/0 بر 15 برای فراهم کردن خوراک دهی نیتروژن محدود منتج به رشدی خطی شد و سرعت رشد سلولی را به ترتیب تا g/lh 64/2 و 85/1 کاهش داد. پس از اتمام گلیسرول اولیه موجود در محیط کشت و افزودن مقدار اضافه تر از گلیسرول، رشد سلولی در شرایط خوراک دهی نیتروژن محدود ادامه یافت. فاز القا با افزودن مخلوطی از متانول و سوربیتول به عنوان گوهرمایه مخلوط و انتخاب مقادیر 5/0 بر 10 و 5/0 بر 20 برای ton/toff در دو کشت مختلف انجام شد. نسبت ton/toff کم تر باعث سرعت رشد و تولید پروتئین نوترکیب پایین تری شد. این یافته امکان کنترل سرعت رشد و تولید پروتئین نوترکیب را در تراکم سلولی بالا با استفاده از راهبرد جدید کنترل نیتروژن محدود تأیید می کند.